摘  要：单细胞凝胶电泳是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂的方法，与传统DNA损伤检测方法相比，SCGE具有简便、快速、经济、灵敏，并无需放射性标记、所需细胞少等优点，适合于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究。该方法广泛应用于DNA修复、遗传毒理、环境监测和细胞凋亡的研究。本文对彗星试验的发展、原理、方法及其在在猪精子质量检测上的应用等方面进行了综述。

关键词：猪精子 单细胞电泳 DNA损伤 

　 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresisassay，SCGE）又称彗星试验（comet assay），是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂的方法。从理论上讲，该方法适用于所有有核细胞，能够灵敏的检测单链和双链DNA的断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤，监测环境污染物对机体的遗传损害，研究毒物致癌机制等有广泛的应用价值。与传统DNA损伤检测方法相比，SCGE具有简便、快速、经济、灵敏，并无需放射性标记、所需细胞少等优点，适合于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究。因此，SCGE技术在近几年取得了很大的发展和广泛的应用。
1 SCGE的发展
　 1978年，Rydberg和Johanson[1]首次定量检测了单细胞DNA损伤，将细胞包埋于琼脂糖，在碱性条件下使DNA解螺旋，中和后用吖啶橙染色，用光度计测定绿光（表明双链损伤）与红光（表明单链损伤）强度，用二者之比来测定损伤程度，但由于处理过程要求十分严格，故该技术未被广泛应用。1984年，Ostling和Johanson[2]发明了微凝胶电泳技术，将细胞包埋于琼脂糖凝胶中，铺于载玻片上，在去污剂和高盐溶液中溶解，然后在中性条件下电泳，溴乙啶染色后，用荧光光度计测定。Olive[3]对上述方法进行了改进，采用了较严格的溶解条件，使中性SCGE成为检测DNA双链断裂（DSBs）的灵敏方法。但该方法不能检测DNA单链断裂（SSBs）。1988年，Singh[4]等提出在碱性条件下进行单细胞凝胶电泳，检测SSBs和碱性不稳定位点，完善了DNA变性和单链DNA的迁移，使该技术在测定DNA损伤与修复中广泛应用。1997年，Santos[5]等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridiza—tion，FISH）结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。2001年，Nadin[6]等建立了SCGE银染法，进一步提高了损伤DNA分析的灵敏度。
2 检测机理
　 单细胞凝胶电泳用于检测有核细胞DNA损伤的技术，可在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复。其基本原理是：在细胞裂解液的作用下，有核细胞的生物膜破坏，使细胞内的DNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯核DNA仍附着在剩余的核骨架上而留在原位。DNA解螺旋后进行电泳，如细胞未受损伤，则核DNA断片较少，片段较大，电泳时DNA因其分子质量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈圆形的荧光团无拖尾现象；若细胞受损，DNA断片较多，在碱性条件下DNA解螺旋变为单链，电泳时因DNA分子量小可以进入凝胶中，向阳极伸展，荧光显微镜下呈一个亮的头部和尾部，形似彗星，故又称彗星实验。DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强，通过测定迁移部份的光密度和迁移长度就可定量测定单个细胞的DNA损伤程度。
3 技术操作及注意要点
　 目前，已建立了多种SCGE实验方法，但都是在Ostling和Singh等的中性和碱性SCGE的基础上改进形成的，其基本原理相同。根据Singh等[4]1988年设计的方法，在60℃下，将100μl正常熔点琼脂糖在无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）浇注到磨砂的显微镜载玻片上，盖上盖玻片，约3分钟待琼脂糖固化后去除盖玻片；在37℃下，将68μl低熔点琼脂糖与16μl（约2000个细胞）的受检细胞相混后，滴于上一层正常熔点琼脂糖上，再将80μl低熔点琼脂糖作为第3层，并加盖玻片，置4℃冰箱5分钟使之固化。然后去掉盖玻片，置载玻片于冰冻的裂解液中2小时，以去除细胞蛋白，再把载玻片置碱性电泳液中约1小时，使DNA链在电泳前解离。在4℃、200mA、25V下电泳30min，取出载玻片，在pH7.5、0.4mol/L三酸盐中浸泡15分钟以中和过多的碱，加溴化乙锭（EB）50mg/L，5分钟后用蒸馏水浸洗，然后加盖玻片待检。荧光显微镜下，每片随机观察约100个细胞，依据DNA 在“彗星细胞”尾部的量对DNA损伤程度进行分级[7]：0级，无损伤，损伤低于5％ ；A级，轻度损伤，损伤5％～19％ ；B级，中度损伤，损伤20％～39％；C级，重度损伤，损伤40％～94％；D级，完全损伤，损伤超过95％。也可微机图像分析如Komet3.0软件，可进行精细的荧光强度、尾矩、尾惯量等指标测定。
　 SCGE虽简单、实用，但在每一步操作中都应特别仔细，否则将难以达到预期目的。（1）实验过程中的细胞数目应该调节至约3.0×105个。如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面的细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；反之如果细胞数目过低，则很难完成对实验结果进行统计分析；（2）载玻片应制作成全磨砂型，保证第一层正常熔点琼脂糖能牢固附着。盖玻片应刷洗干净（碱洗，酸泡）以制作完好的“三明治”琼胶板；（3）含有细胞的整个过程须在暗光下进行，尤其是从组织块到制成单细胞悬液的过程应严格按照操作过程，最后需计数细胞成活率，防止假阳性结果；（4）建议在4℃冰箱中电泳，防止电泳液产热造成低熔点琼脂糖（37℃熔化）中细胞DNA内容丢失；（5）SCGE一般选用低电压（0.5～5V/cm）和短时间（5～30min）。电压过高、电泳时间过长虽然能提高检测灵敏度，但可能会使正常的细胞形成少许拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果；（6）EB或碘化吡啶（PI）染色后，可用蒸馏水冲洗或浸泡1～2次，降低未结合染料所引起的背景荧光，以检测极少量的DNA；（7）低熔点琼脂糖与细胞悬液的混合液应确保在35～37℃之间，防止细胞热损伤；（8）EB和PI均为强嵌入剂，应安全操作并进行净化处理；紫外线有危害性，对眼睛尤甚，应有安全保护工具；（9）EB在高pH环境中不与DNA结合，染色前一定使附有琼脂糖凝胶的载玻片在中性液中浸泡15分钟。
4 彗星图像分析
　 随着彗星试验的发展，彗星分析软件的出现使人们能够进一步分析一些无法用肉眼测量的能更精确反应彗星水平的指标如尾矩、尾部DNA含量等。目前，除了昂贵的商业软件外，也出现了一些免费的彗星分析软件。如Helma等所设计的软件（Sieion Image）能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA含量、尾矩等多项参数，而且该软件可根据需要进行修改，并具有操作简便、快捷的优点[8]。Konca等在Helma的基础上研制了另一软件（CASP），该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量的彗星参数中增加了Olive尾矩，而且用户界面更友好[9]。除了国外免费的分析软件外，国内朱正良等研制的彗星图像分析软件（IMI）也具备了上述软件的优点，而且在中文界面下使用起来更方便快捷[10]。
　 为了减少人为因素的干扰，Bocker等研制了彗星自动分析系统。该系统能自动识别细胞，并自动对彗星进行分类并定量，大大提高了彗星图像的分析速度，l5分钟内能分析100个彗星图像[11]。随后，Frieaufr[12]等研制了一个更快捷的由计算机操作的图像分析系统，该系统在不需要任何人参予的情况下，3小时内能分析l6个样品。其结果与人机交互式的分析结果高度一致。另外，一种激光扫描共聚焦显微镜也被用于彗星图像的采集分析，由于其能够对细胞进行断层扫描，而且每分钟能扫描30个细胞，增加了试验结果的准确性和可靠性[13]。随着彗星试验方法的不断改进，各种彗星试验试剂盒也应运而生，使试验进一步简化。
5 SCGE存在的主要问题
　 SCGE技术自出现以来，很多研究人员都致力于应用与开发研究，包括试验条件的完善、专用图像分析系统的设计等。目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国Kinetic Imaging公司的KOMET和德国Zeiss公司的KS400分析系统，但这些软件均需与其相应的仪器设备配套使用，价格十分昂贵，因此，我国大部分研究人员均采用荧光显微镜下根据损伤程度分级和目镜测微尺测量彗星长度的方法，这类方法虽然方便实用，但其主观性强、定量化程度不够。另外，SCGE仅能反映基因组总DNA的初级损伤，而无法区分是哪种特定基因的DNA损伤。随着SCGE技术与其他基因分析技术的有效结合，如SCGE技术与FISH技术的结合等，SCGE技术的应用将会拓展出一片新的广阔天空。
6 SCGE在猪精子质量检测上的应用
　 SCGE作为检测单个细胞DNA损伤的一种简便、灵敏的方法，在许多领域应用，但是应用该技术检测精子DNA损伤报道却较少。主要是由于精子DNA双螺旋与核蛋白构成了精子细胞的基本结构。核蛋白由85%的鱼精蛋白和15%的组蛋白组成。DNA链与鱼精蛋白之间由牢固的二硫键连接，形成了细胞核的独特致密结构，DNA很难从核蛋白中分离[14]。Singh等首先采用蛋白酶K去除鱼精蛋白，解决了这一难题。Fraser和Strzeek于2004[15]和2005[16]年利用SCGE分别对液态和冷冻保存猪精子DNA的完整性进行了检测。李文烨等[17]也利用SCGE检测了低温保存猪精子的DNA损伤。采用2%β-巯基乙醇对精液进行预处理以破坏DNA链与鱼精蛋白之间的二硫键，从而加快了精子染色体的解聚，同时用RNase-A和蛋白酶K进行消化处理达到分离精子DNA的目的。

猪精子DNA完整性检测的方法为[17]：

　 样品处理：将精液用PBS洗涤调整细胞密度至2×105/ml。实验样品用2%β-巯基乙醇在4℃下孵育1小时 ，冲洗，离心。
制片：剪取0.5mm的医用胶布，将载玻片围成长约2cm的正方形框。先在该正方形框内铺上100μl 0.75%（w/v）正常熔点的琼脂糖（NMA），盖上盖玻片使胶定型，在室温下静置5min，此为底层胶。待胶凝固后取下盖玻片，将10μl精子细胞悬液与75μl 0.5%的低熔点琼脂糖（LMA）在37℃条件下轻轻吹打混匀，立即铺在底层凝胶上，盖上盖玻片待胶凝固后取下。
　 精子裂解：将铺好胶的盖玻片置于裂解液中，在4℃条件下裂解2小时 ，然后RNA酶4℃条件处理4小时 。最后将玻片移至含蛋白酶KL的裂解液中37℃过夜处理。
　 电泳：玻片在含有300mmol/L醋酸钠，100mmol/L Tris的弱碱性电泳液（pH值9.0）中平衡20min，在12V、100mA、室温条件下电泳1小时 。
　 中和：从电泳液中取出凝胶载玻片，小心吸除残留的电泳液，立即用预冷的中和液漂洗3次，每次10min。操作要在4℃温度下避光进行。
　 染色和观察：取出凝胶载玻片，在胶面上滴加25mg/L EB 50μl，盖上盖玻片，4℃避光染色20min。用倒置荧光显微镜观察。
　 精子DNA的损伤分级：根据彗星尾部的DNA含量将DNA损伤程度分为5级。0级：<5%，无损伤，精子核完整；1级：5%～20%，轻度损伤，可见彗尾，精子核基本完整；2级：20%～40%，中度损伤，可见明显的彗尾，精子核缩小；3级：40%～95%，重度损伤，彗尾荧光信号强而密，并见明显缩小的精子核；4级>95%，完全损伤，仅见荧光强而密的彗星，精子核基本消失。
　 SCGE由于其快速、简便和灵敏，已广泛应用于检测淋巴细胞[18]、人类精子细胞[19]、鱼类冷冻精子DNA[20-22]的损伤研究。应用该技术检测猪精子DNA的完整性，在分子水平上对精子的质量进行检测，探讨SCGE技术在评估猪精液保存和人工授精中的意义，对建立适宜的猪精液保存方法以及优良种公猪种用价值的评定具有很强的指导意义和广泛的实用价值。
参考文献
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