摘  要：为摸索一种较实用的猪精子冷冻方法，探讨了不同精子密度（0.2×109、0.5×109、0.7×109和1×109个/mL）和不同平衡时间（0.5、1、2、3h）对猪精液冷冻效果的影响。试验采用0.25mL细管进行精液冷冻，以精子活力、畸形率、质膜完整率和顶体完整率作为解冻后精子检验指标。结果显示，0.5×109个/mL猪精子冷冻解冻后，精子活力、质膜完整率和顶体完整率均显著高于密度为0.7×109个/mL、1×109个/mL两组（P<0.05）。畸形率与其它三组无显著差异（P>0.05）。平衡2h组在精子活力和顶体完整率上明显高于平衡0.5h、1h和3h组（P<0.05），畸形率和质膜完整率较其它三组无显著差异（P>0.05）。由此得出如下结论，猪精子密度为0.5×109个/mL，适宜的平衡时间为2h，用0.25mL细管冷冻可获得较好的冷冻效果。

关键词：猪精子 精子密度 平衡时间 精液冷冻

　 Effects of Sperm Concentration and Equilibration Time on Cryopreservation of Boar Spermatozoa in 0.25mL Straws
Liang Hong-bin  Li Jing  Li Bo Han  Guo Yong  Liu Yun-hai  Ni He-min
　 (Department of Animal Science & Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing, 102206, China)
Abstract：The effects of different sperm concentrations (0.2×109spz/m、0.5×109 spz/m、0.7×109 spz/m、1×109 spz/m) and equilibration time (0.5、1、2、3h) on cryopreservation of spermatozoa of boar were studied. Cryopreservation of boar semen in 0.25 mL straws, the sperm motility, morphology, membrane integrity and acrosome integrity were examined before freezing and post-thawing. When the concentration of 0.5×109 spz/m was applied, the post-thawing motility, membrane integrity and acrosome integrity of spermatozoa were significantly higher than the group of 0.7×109 spz/m and 1×109 spz/m (P<0.05). There were no significant differences in morphology between them. (P>0.05). The post-　 　 thawing motility and acrosome integrity of spermatozoa were significantly higher (P<0.05) for 2h equilibration group than those for 0.5h, 1h, 3h equilibration groups，but the post-thawing morphology and membrane integrity of 2h equilibration group had no significant difference with other 3 groups. (P>0.05).These results suggest that the concentration of 0.5×109 spz/m and 2h equilibration are beneficial for freezing boar spermatozoa in 0.25mL straws.
Key words: Boar semen, Sperm concentration, Equilibration time,semen frozen 

　 精液冷冻和人工输精技术的应用及推广，是上个世纪以来家畜繁殖领域的重大创新和革命，对于充分发挥良种公畜的遗传品质以及保护公畜遗传资源均具有极其重要的应用价值。但到目前为止，猪冷冻精液生产由于解冻后精子活力低、受胎率低等原因，使得猪冷冻精液技术一直停留于实验室阶段，难在生产中大范围推广应用。因此，深入系统地研究猪精液冷冻机理和生产的关键技术，已经成为国内外养猪业生产中亟待解决的问题，对于丰富家畜精液冷冻研究的知识也具有重要意义。
　 精子密度的研究是精液冷冻保存技术关键技术之一，通常精子密度分为高密度、中密度、低密度三种。在猪精液冷冻的研究中，精子冻存密度一般为（5~10）×108个/mL ，人工授精所需液态保存精子数为20~30亿，冷精则需要更多，一般为50~60亿。Roca[1]等用0.5mL细管冷冻精液，含精子量1×109个/mL，解冻后进行人工授精，获得了较好的繁殖效果。Saravia[2]研究报道，以2×109个/mL的密度冻存猪精子，冻后活力为37%~46%。精子密度受冷冻承载工具体积的限制，很难到达输精量的需要，因此研究猪高密度冷冻将很有意义，高密度精液使其精子活动空间变小，降低了精子的活动量和耗氧量，增加了精子营养需求。这将有可能缓解冷冻过程中对精子的损伤，提高冷冻效果。目前国内外对于这方面的报道很少，还需更多的研究来证明。
　 平衡时间是猪精液冷冻前必要的冷冻程序，目的是使精子有一段适应低温的过程，同时使甘油充分渗透进精子体内，达到抗冻保护作用。在所有家畜中，公猪的精子对冷休克最敏感，低温打击严重影响精子的活力。缓慢的降温有利于提高精子对低温的耐受性。在室温下将精液静止一段时间对解冻后精子活力有显著提高（P<0.01） [3]。随着平衡时间的延长，对低温打击的抵抗能力逐渐增强，Butler[4]通过实验认为，猪的精子在室温放置几个小时可获得对抗冷休克的能力，在平衡2~7h后，大部分精子提高了抗冻力。Guthrie HD[5]等（2005）发现平衡时间从3h增加到24h对使用冷冻解冻精液进行人工授精的23d妊娠率没有明显的影响，但是胚胎的数量从15枚降低到9枚，回收可用胚胎的比率从73%降到47%。
　 鉴于以上现状，本试验在0.25mL细管猪精液冷冻基础上，研究了不同精子密度和不同平衡时间对猪精液冷冻解冻效果的影响，旨在探索优化猪精液冷冻程序，提高冷冻效果。
1 材料与方法
1.1 猪精液来源
　 采自北京顺义浩邦种猪场的皮特兰种公猪。
1.2 主要试剂
    葡萄糖、柠檬酸钠、甘氨酸等，试验所用试剂，除特别指明外，均购自国内。Tris（Sigma），BSA（Sigma）。
1.3 精液的采集
　 采用手握法或假阴道法采精，用4层灭菌纱布或专业滤纸过滤胶状物，采精后进行常规检查，并根据精液浓度用稀释液稀释，精液在17℃条件下1h内运抵实验室，并检测精子的活力、质膜完整率和顶体完整率。最后取活力在0.7以上，密度“中”，畸形率15%以下的精液用于冷冻保存试验。
1.4 精液的稀释与平衡
　 精液在室温静置lh，然后1500r/min离心10min，弃上清液。采用二次稀释法进行稀释，先在室温下用稀释液Ⅰ（2.1g葡萄糖、3g乳糖、0.31g柠檬酸钠、0.8g甘氨酸与20mL卵黄以三蒸水定容至100 mL）作1:1（V/V）稀释，然后将稀释精液和稀释液Ⅰ液一起放入4℃冰箱内，缓慢降温到4℃（约2h）。用稀释液Ⅱ液（在稀释液Ⅰ液的基础上添加甘油冷冻保护剂，甘油最终浓度为3%）做1:1（V/V）稀释，保持精液最终稀释比例为1:3，再进行平衡数小时，检查精子活率，取活率在0.6以上的精液直接进行冷冻。
1.5 精液的冷冻
　 向广口塑料泡沫盒内倒入约1/3容积液氮，再放入自制的铁架，加盖后平衡 15min左右，至液面上无白色液氮蒸汽。将预处理后的精液装入经5℃预平衡的 0.25mL塑料细管，封口并放置于液氮面上适当高度处，加盖后使样品在液氮面上熏蒸，然后直接投入液氮保存。
1.6 精液的解冻
　 从液氮中取出精液细管，迅速浸入37 30s，轻轻摇动至融化。室温下将精液和解冻液（5g葡萄糖、0.5g柠檬酸钠、10IU青链霉素以三蒸水定容至100mL）按1：3（V/V）比例混合，在37℃水浴孵育 30 min后，镜检精子活率。
1.7 解冻后精液品质的检测
1.7.1 精子活力的检测
　 把待检精子样本稀释到1×107mL，取5ul精液滴在温热的载玻片上，迅速盖上盖玻片，放在相差显微镜下计数，至少计数200个精子，计算精子活力＝直线运动的精子/总精子数。
1.7.2 顶体完整率的检查
　 把待检精子样本稀释到1×107mL，取大约10ul精液滴在载玻片上，用另一个载玻片把精滴轻柔地涂满盖玻片，自然风干，然后用中性福尔马林固定15min，冲去固定液，风干后投入姬姆萨染缸中，染色90min，用细水冲去多余染液，风干在100×油镜下观察。至少计数100个精子。
1.7.3 质膜完整性的检查
　 用低渗肿胀实验（HOST） [6]测定精子样本的弯尾率即是质膜的完整率。把精子样本稀释到1×106mL，取500ul加入 1mL的低渗液中，37℃水浴温浴 60min。取5uL精液滴在温热的载玻片上，迅速盖上盖玻片，放在相差显微镜下计数，至少计数100个精子。
1.7.4 冷冻后精子的体外受精实验
　 自屠宰场采集猪卵巢，用抽吸法采集直径在2~5mm卵泡卵母细胞。选择胞质均匀，含有3层及以上致密卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COC），成熟培养时，将COC以15枚一组，置于覆盖有石蜡油的成熟培养液（TCM199、10%pFF、10IU/ml hCG、10IU/ml PMSG、0.1mg/ml L-半胱氨酸）滴中，于38.5℃、5%CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。卵母细胞在成熟培养44~46h后，用0.1%透明质酸酶处理体外成熟卵母细胞1~2min，轻轻吹打，脱去卵丘细胞，再用mTBM液清洗2次，15枚一组放入平衡的50uLmTBM中，等待受精。
　 冻精解冻后，37℃水浴锅中平衡10min后，离心洗涤（1500rpm，5min），弃上清；再加入2mLDPBS液，重新悬浮精子后再离心、弃上清；加入2mLmTBM液，悬浮精子，离心弃上清；用添加肝素（200ug/mL）的mTBM液调节精子密度至1×107个/mL，取50uL加入含卵母细胞的mTBM液中进行受精，受精液中精子密度为5.0×106个/mL。
　 精卵共同孵育6h后，转入经隔夜平衡的PZM3培养液中洗3~4次。将受精卵以15枚一组，移入隔夜平衡的50uLPZM3培养液中培养。培养条件为38.5℃、5%CO2气相和饱和湿度；培养3d后检查卵裂率，6d观察胚胎发育情况。
1.8 实验设计
　 实验一：不同精子密度对猪精子冷冻效果的影响，通过两次不同比例的稀释，将精液分为4组，冷冻前最终精子密度为：0.2×109个/mL、0.5×109个/mL、0.7×109个/mL、1×109个/mL。
　 实验二：不同平衡时间对猪精子冷冻效果的影响，根据实验一的结果，将精液分为4组，冷冻前平衡不同时间（0.5、1、2、3h）。
1.9 数据分析
　 采用DPS 7.05分析软件对数据进行显著性检验, 每一指标之间做差异显著性分析。相关数据采用t检验进行统计学处理。P<0.05视为存在显著性差异。
2 结果
2.1 不同精子密度对猪精子冷冻效果的影响
　 表1 不同密度精子冷冻后效果
Table 1 Results of boar semen freezing in different sperm concentration

精子密度（109个/mL） Sperm conccentration	活力 Motility	质膜完整率/% Plasma integrity	顶体完整率/% Normal acrosome	畸形率/% Abnormality
0.2	0.34±0.05a	27.9±4.0b	49.9±4.1b	35.2±4.2a
0.5	0.35±0.04a	35.4±4.2a	58.1±1.6a	33.3±3.0a
0.7	0.24±0.03b	22.0±1.2bc	40.8±3.5c	38.0±3.0a
1.0	0.14±0.05c	20.2±1.3c	38.9±2.3c	39.5±2.0a

注：上标含不同字母表示差异显著（P<0.05）；含相同字母表示差异不显著（P>0.05）    
(Note: The different letters indicate the significant differences among them, P<0.05; but the same ones indicate no significant differences among them, P>0.05)
　 由表1可知，猪精子密度为0.2×109个/mL 和0.5×109个/mL时，解冻后精子活力优于密度为0.7×109个/mL和1.0×109个/mL两组，差异显著（P<0.05）。但两者之间差异不显著（P>0.05）。猪精子密度为0.5×109个/mL时，质膜完整率和顶体完整率高于其它三组，差异显著（P<0.05）。猪精子密度为0.5×109个/mL时，畸形率与其它三组差异不显著。结果表明：猪精子密度为0.5×109个/mL时，冷冻效果较好。
2.2 不同平衡时间对猪精子冷冻效果的影响
表2 不同平衡时间对猪精子冷冻效果的影响
Table 2 Effects of boar semen freezing in different equilibration time

平衡时间（h） Equilibration time	活力 Motility	质膜完整率/% Plasma integrity	顶体完整率/% Normal acrosome	畸形率/% Abnormality
0.5	0.20±0.04b	26.2±5.7a	44.4±6.7b	33.8±4.6a
1	0.27±0.04b	29.1±3.1a	43.6±5.0b	33.8±3.4a
2	0.35±0.04a	33.0±8.9a	51.8±6.8a	32.2±5.6a
3	0.22±0.04b	26.4±4.2a	41.2±4.6b	34.4±5.5a

注：上标含不同字母表示差异显著（P<0.05）；含相同字母表示差异不显著（P>0.05）    
(Note: The different letters indicate the significant differences among them, P<0.05; but the same ones indicate no significant differences among them, P>0.05)
　 由表2可见，在活力上平衡2h组明显高于平衡0.5h、1h和3h组，差异显著（P<0.05），而平衡0.5h、1h和3h组之间无明显差异。顶体完整率以平衡2h组最高（51.8±6.8%），与平衡0.5h、1h和3h组之间存在差异（P<0.05）。平衡2h组的质膜完整率和畸形率均好于平衡0.5h、1h、和3h组，但差异不显著。
2.3 体外受精结果
表3 冷冻和新鲜精液体外受精能力的比较
Table 3 Compare between the frozen and fresh semen on the developmental ability after IVF 

组别        Group	活力 Motility	卵母细胞数    No.treatmented oocytes	卵裂率/%   Cleavagerate
鲜精	0.75	327	42.8±4.0a（141/327）
冻精	5	226	37.7±1.8a（86/226）

注：上标含不同字母表示差异显著（P<0.05）；含相同字母表示差异不显著（P>0.05）    
(Note: The different letters indicate the significant differences among them, P<0.05; but the same ones indicate no significant differences among them, P>0.05)
结果表明，新鲜精液和冷冻精液经体外受精后在卵裂率上无显著差异（P>0.05）。
3 讨论 
3.1不同精子密度对猪精子冷冻效果的影响
　 在精液冷冻过程中，调整精子密度是一个必要的过程，但精子密度的高低是否对冷冻效果产生影响，高密度冷冻是否可以提高冷冻效果，还不是很清楚。Woelders[7]等用猪精液进行冷冻，冷冻密度为1.5×109个/mL组，解冻后精子活力、活率和顶体完整率低于密度为0.15×109个/mL的组。本试验用0.25mL细管冷冻精子密度为0.5×109个/mL时，解冻后精子活力、质膜完整率、顶体完整率、畸形率均获得了良好的效果，优于精子密度为1×109个/mL。这与文献报道的基本一致。但与芮荣[8]等用0.25mL细管高密度精液冷冻结果存在差异。原因可能是冷冻程序或冷冻液不同。从本试验结果看，高密度的猪精液冷冻可以提高冷冻效果，但对高密度精液的范围问题，是否是密度越高冷冻效果越好，以及高密度精液提高冷冻效果的机制问题还未系统的研究，今后还需要更加深入的研究从而提高和稳定冷冻效果。
3.2不同平衡时间对猪精子冷冻效果的影响
　 平衡时间是影响冷冻复苏精子存活率的一个重要因素。对于不同动物来说, 甘油透过精子细胞膜的速度是不同的，对低温耐受性也是不同的。在所有家畜中，猪精子对低温打击和冷冻都很敏感，但随着平衡时间的延长，对低温打击的抵抗能力逐渐增强，所以目前多采用2h~4h平衡。实验证明，延长平衡时间可进一步增加对低温打击的抵抗力。Marco F[9]等的研究表明，牛精子平衡120min可获得较高的精子运动度。李亚辉[10]等在对食蟹猴精子冷冻平衡时间的研究表明，30min平衡可获得比较高的精子运动度。在猪精子方面大部分研究者采用120 min平衡时间。这与本试验的研究结果相一致。另外，平衡时间受冷冻载体的容积和精子密度的影响，容积越大或密度越高，精液平衡时间越长，反之，平衡时间越短[11]。在实际生产过程中应根据冷冻载体的容积或精子密度的变化，调整平衡时间适宜的范围，从而达到最佳的精液冷冻效果。试验结果表明，猪精子密度为0.5×109个/mL，用0.25mL细管冷冻适宜的平衡时间为2h。
参考文献
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