摘　要：鉴于人工授精技术的成熟性和众多优点，近几十年来在集约化养猪生产中得到了广泛应用。同时，随着相关生理生化技术的进步，其技术的发展较快，特别是精液冷冻保存技术、XY精子分离技术、子宫颈后和子宫深部、腹腔镜人工授精等技术成为近几年来在人工授精技术上研究的热点和发展的方向。本文简要概述了猪冷冻精液、猪子宫内人工授精及性控精液技术在现阶段的研究及应用。

关键词：猪；人工授精；子宫内输精；性控精液

　　猪人工授精技术是用人工方法采集公猪的精液，经过精液品质检查、稀释、保存等一系列处理后，再将精液输入到发情母猪的生殖道内以达到受胎目的的配种方法。猪人工授精技术是养猪生产中经济有效的技术措施之一，其最大的优点是减少猪群中所需公猪的总数，增加优良公猪的利用机会。
自20世纪50年代人工授精技术成熟，并开始应用于生产，但在全世界范围内迅速普及，则是在80年代才开始。目前使用人工授精技术比较广的欧洲、美国等国家，普及率已超过80％。近十年来，发达国家的猪人工授精技术又有了新的发展和突破。
1 猪冷冻精液人工授精
　　猪精液冷冻技术是指利用干冰（-79 ℃）、液氮（-196 ℃）、液氦（-269 ℃）等作冷却源，将精液经特殊处理后，保存在超低温状态下，使精子细胞的代谢完全停止，达到长期保存精液的目的。需要使用时经解冻便可用于输精。
　　1956 年，Polge 开始研究猪精液的冷冻保存，1970 年，Polge 利用外科腹腔授精法将解冻后的精子直接注入输卵管，并获得83%的受精卵。随后Crabo 和 Einarsson（1971）、 Graham 等（1971）、 Pursel 和Johnson（1975 ）相继报道了以常规的子宫颈输精方式授精并成功分娩的冻精技术试验结果，证明在经过超低温冷冻保存后，猪精子仍具有受精能力。
　　使用冷冻—解冻精子与液态保存精子相比，胚胎透明带附着的精子数量大约少10倍左右，输精的精子数量前者比后者要多2倍。而且在最好的繁育管理条件下也只有大约70%的受孕率。这就限制了冷冻精液在养猪业世界范围内的商业化应用。目前，冷冻精液在世界范围内的人工授精中应用不到1％。
 生产上，猪精液冷冻主要是颗粒法、5 mL细管法及5 mL扁平袋（Flat-Pack）法，其中5 mL细管法及5 mL扁平袋（Flat-Pack）法保存效果要优于颗粒法。采用常规人工输精方法――子宫颈输精法（intra-cervical insemination，intra-CAI），对自然发情母猪进行2次人工授精（50亿～60亿/次）后的结果显示：5 mL扁平袋（Flat-Pack）法的效果最好，产仔率与平均窝产仔数分别达到72.2%和10.7头（Eriksson et al，2002）；5 mL细管法的产仔率与平均窝产仔数分别为62.6%和9头（Hofmo and Grevle，2000）；颗粒法最差，产仔率与平均窝产仔数仅为40%和6.4头（Didion and Schoenbeck,1996）。
　　随着输精技术的改进——新的子宫角输精法（deep uterine insemination，DUI）的采用，最大限度地降低了猪精液的输精量。这种非手术的子宫角输精法最早是由Martinez等（2001）采用一种柔性光纤内窥镜（长度：1.35 m；外直径：3.3 mm；内直径：1.2 mm）实现的。这种输精装置插入到子宫角的时间为4.1±0.26 min。应用新的子宫角输精方法的鲜精（每次10亿，2亿，0.5 亿）输精效果与常规输精法（30亿/次）在产仔率与平均窝产仔数上差异不显著（Martinez，2001）。
　　在猪的冷冻精液方面，新的子宫角输精方法可使冷冻精液的输精量降为10亿/次，而不影响输精效果，这使得0.5 mL细管冷冻法应用到生产上成为可能。其中，采用激素诱导，一次人工授精，产仔率与平均窝产仔数分别达到77.55%和9.31头（Roca et al，2003）；而对自然发情母猪，进行2次人工授精，产仔率与平均窝产仔数也分别达到70.1%和9.18头（Bolar′n et al，2006）。在2009年湖北省畜牧所试验猪场引进的猪冷冻精液，采用子宫角内人工授精试验中，结果显示，对于自然发情母猪，进行2次人工授精，产仔率与平均窝产仔数分别为52.7%和9.87头。
　　目前，猪精液冷冻技术的研究还处于试验阶段，主要集中在以下几个方面：精细胞冷却和冷冻的保护剂；精子表面膜的变化与外周环境（保护剂浓度、冷却速度、解冻速率等）的关系；精液冷冻的剂型与解冻后精子活力和受胎率的关系；对精子染色体结构分析，以便准确判断精液品质与受胎关系；简便、易行、廉价且受胎率高的冷冻工艺流程与解冻方法。
2 猪子宫内人工授精（IUI）
　　不管是自然交配还是传统的人工授精方式，均存在着巨大的精子资源浪费。猪子宫内人工授精技术可很好地解决这一问题，其精液需要量只需保证每份精液总精子数不少于10亿个精子，即可达到与传统猪人工授精技术相当的效果。猪子宫内人工授精(IUI)，是利用特制的输精导管将精子驻留于距子宫颈15～20cm子宫腔内的一种输精技术。德国（Rath等，1999）和西班牙（Martinez等，2001）已在实验室研究出IUI授精程序。2001年，法国的一些公司发明了专用输精管，并在人工授精中心实施成功。
猪子宫内人工授精技术具有传统人工授精技术（子宫颈处）几乎所有优点。另外，与传统的每份精液30～40亿个精子的一次输精剂量相比，大大节约了精子资源，同时能有效地防止了精液倒流现象，减少了精子浪费，从而减少种公猪引进及饲养费用开支，并且对充分发挥特级种猪的遗传潜力开辟了新的途径。
2.1　子宫颈后（子宫体）授精（IUBI）
　　猪的子宫体输精位置在子宫颈和子宫角分支之间，大约有5 cm。使用子宫体输精时，采用一个细的和半软的输精装置通过一个事先插入子宫颈皱褶的常规导尿管，将精液放置到子宫体内。IUBI 法存在从子宫体（放置精液的位置）到输卵管（受精部位）的运输过程中精子损耗的问题。
　　Waston&Behan（2002）在英国使用10亿精子通过子宫颈后授精技术给3240只经产母猪输精，产仔率为88.7％，胎产仔数为12.1头/窝，与常规子宫颈内授精的产仔率91.3％，胎产仔数12.5头/窝相比无显著差异。英国伦敦皇家兽医学院学者们（2002）的研究表明分别每次用20亿和30亿精子进行深度授精，其产仔率（>90%）及出生仔猪数与传统人工授精相当，而用10亿精子低剂量授精时，深度授精可获得89%的产仔率，而普通人工授精仅为66%。IMV国际公司项目经理Angela DeMirjyn介绍说一头普通公猪射精量约600～700亿个精子细胞，生产约25头份常规人工授精稀释精液，如果采用IUI技术，相同射精量能生产45～50头份的稀释精液。然而，Roberts＆Bi lkei（2005）在匈牙利和克罗地亚对1783只经产母猪分别使用10亿精子子宫颈后授精和30亿精子子宫颈内授精，尽管两者在产仔率上相似，但子宫颈后授精的母猪胎产仔数却明显少（前者10.2只，后者12.3只）。这些结果与Rozeboom等（2004）于美国研究报道一致。当尝试更少输精数量时，即每次输精5亿精子，产仔率和胎产仔数更低。
　　因此，采用子宫颈后授精方式直接把每次10亿精子输入子宫体，可获得正常的产仔率，但胎产仔数可能下降。使用子宫颈后授精，半软授精装置越过子宫颈皱褶，精液逆流可减少20％，因此，输精量减少不会影响产仔率，然而，每胎产仔数减少的原因还不清楚。Waston＆Behan（2005）认为是非正规的授精造成的，因为缺少对使用子宫颈后授精装置操作的训练。另外，一些其他原因，如老化的精子，操作不当或者输精与排卵时间间隔等，在使用的精子数量较少时都会导致繁殖率下降。在当前生产条件下使用子宫颈后授精，10亿输精数量似乎不能达到正常繁殖率。因此，为了获得高繁殖率，应该考虑增加输精数量。
2.2　子宫角深部输精（DIUHI）
　　为了进一步降低每次输精的精液剂量，Rath 等（2002）发明了一种比IUBI 法使用更少精液的方法。即通过一个事先插入子宫颈皱褶用作向导的常规授精输尿管，把一个柔韧纤细的装置导入子宫角。此装置能够顺着子宫腔前进，将精液输入到子宫角近端1／3处。
　　Vazquez等（2001）在西班牙对329只经产母猪使用子宫深部授精（1.5亿精子／次）一次、2次或3次以及子宫颈内授精（30亿精子／次），结果表明，产仔率为83.3％一87.3％，胎产仔数为9.2-10.4头/窝，两种授精方式之间无统计学差异，但子宫深部授精的胎仔数总是最低。Day等（2003）在美国对105只经产母猪分别采用2次子宫深部授精1.5亿精子或者子宫颈内授精30亿精子，两者之前产仔率无统计学差异（子宫深部授精83％，子宫颈内授精90%），但子宫深部授精的母猪每胎产仔数较少（前者10.5头，后者12.9头）。从两个研究中结果可以推测，可以通过增加每次授精的精子数来克服胎产仔数的下降。
　　与子宫颈内授精相比，子宫颈后授精和子宫深部授精方式都可以减少每次对冷藏精子数目的需要。每次输精10-15亿（子宫颈后授精）或6亿（子宫深部授精），即可达到子宫颈内授精（30亿精子每次）的授精效果。
因此，这两种方式都可以被视为在生产条件下使用冷藏精液的实用、有效的授精方式。特别是在精源有限或者需要尽可能有效地使用高质量的种公猪精液的情况之下。但该技术中，如何将输精管准确的插入到子宫及子宫深部需要进行培训和练习。授精后，母猪阴户或者阴道内膜可能会由于摩擦出现外伤，应该是对装置的不正确操作所致。同时，利用该技术给初配猪授精要慎重，因为初配母猪子宫颈比较狭小，装置通过比较困难。
3 猪的性控精液人工授精
　　在猪的生产中，需要后代为单一性别的母猪或者公猪以利于管理和销售。目前在欧洲已经开始讨论制定法律禁止进行公猪的阉割，而在猪的育种中，则需要控制后代的性别。因此对于猪的性别控制的要求十分迫切。
获得性控后代的唯一方法就是在受精之前, 将带X染色体的精子从精子中分离出来。至今被证明有效控制后代性别的方法是贝尔兹维精子性别鉴定技术（Beltsville Sperm Sexing Technology，BSST）。目前BSST使用一种专为检测而设计的改进的精子流式细胞仪/细胞分选器(MoFlo)来检测。已知公猪的Y 精子携带的DNA 含量要比X 精子少3.6%。它的工作原理是将经过活体DNA 荧光染料染色的精子通过分选器，当单个精子穿过一束激光（125 mW，1～2 s）时根据与DNA 含量有关的荧光的强弱来根据DNA 含量来分离携带X、Y 染色体的精子。
目前的研究表明，5 000 万精子子宫深部输精即能够成功妊娠。虽然应用上存在限制，低剂量输精技术对于优化性别鉴定精子十分重要。在目前的发展阶段，应用猪性别鉴定精液与冷冻精液的应用相似，主要用于改良。Martinez 等发明了一种输精枪，可以有效地使用冷冻精液和性别鉴定精液（5 000～7 000 万）。Rath 等已有应用性别鉴定精液，进行子宫内人工输精来预先决定后代性别的成功报道。Martinez等（2001，2002）使用特殊的深部输精枪进行子宫内输精，获得了一窝全部为雌性的仔猪。Grossfeld R等报道，使用特殊设计的输精枪，子宫角深部输入50×106 性别鉴定精子，获得了33.3%的妊娠率。另外，使用性别鉴定精液进行试管授精（IVF）可以有效地生产性别鉴定胚胎。
　　最近研究显示，最少1000万冷藏精子通过外科手术植入子宫输卵管结合部，可得到89％的受孕率。Vazquez等(2003)报告，用激素处理46只经产母猪，一次授精最少5000至7000万新鲜性控精子，产仔率达到40％。但每次授精所需精子数量还是太大，因此，对性控精液而言，子宫深部授精不能认为是一种有效的输精方式。
在意大利完成的一项近期试验中，Fantinati等(2005)通过腹腔镜手术，把精子输入到接近子宫输卵管连接处，达到高受精率所需的冷藏精子数量可以减为每个子宫角500万个精子。这种腹腔镜技术已经被证明可用于性控精液输精。最近报道，使用腹腔镜法，每个子宫角最低30万个性别分离精子，即可达到80％的受孕率。此外，近来的研究也证明，必须在排卵前输精才可获得最高的繁殖率，因为性别分离精子在雌性生殖道中的存活时间较短。
4 小  结
　　猪的人工授精技术已经发展了近30年，与本交相比由于其在提高良种利用率；克服体格大小的差别，充分利用杂种优势；减少疾病的传播；克服时间和区域的差异，适时配种；节省人力、物力、财力，提高经济效益等方面的优势，在集约化养猪生产中得到了广泛应用，对提高全球猪育种和猪肉生产产业中着重要的促进作用。
　　随着生理生化技术的进步，如精液冷冻保存及XY精子分离技术的发展，对人工授精技术的要求越来越高，常规人工授精技术不能达到其预期的目的。近年来，子宫颈后和子宫深部、腹腔镜人工授精等技术使这些技术的应用成为可能，而且大剂量新鲜或冷藏精液进行子宫颈内授精可以得到较高的繁殖率。但由于施用成本较高，以及需要熟练的人工授精操作技术等原因，而未能在生产上广泛应用。
但综合分析其成本以及其可能带来的经济效益，这些技术仍有其广泛的应用前景。近年来经过改进的子宫体内输精和子宫角深部输精技术结合精液冷冻和精液性别鉴定技术还将继续推动人工授精技术在猪的育种、畜群管理和特殊商品猪生产领域的应用。此外，一些新的繁殖生物技术如精子为载体的转基因、精子胶囊和精子冻干技术的研究都将会得到发展，然而其在生产中的应用与推广，最终还是取决于它们的实际利用效率，这一点则依赖于有效的输精方式。

参考文献
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