摘 要：笔者对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。经过对比实验，我们最终确定了最优处理，分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA能够取得更好的效果；在本研究采用的1.5ml提取体系中加入50～100ul的精子沉淀，利用PK终浓度至200ug/ml消化6～12h，随后采用氯仿抽提1次，其余步骤按文中通用步骤所述，就可以获得高质量的基因组DNA。同时本研究也确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.8%，电压为80V/20cM，DNA上样量为2ug，电泳至少30min。

关键词：猪 精液 DNA提取 DNA检测 优化 

　 基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容之一。猪是我国重要的动物性蛋白来源。在实际育种生产和科学研究过程中，我们通常需要大量高质量的公猪基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于公猪而言，公猪的精液是相对于其他组织更容易获得的，所以利用精液来提取公猪DNA是更有效的方法。但国内目前尚没有最优化的公猪精液基因组DNA提取方案的报道。
　 提取动物基因组DNA的方法种类繁多，目前主要分成两种，一是试剂盒法，二是经典的酚仿抽提法。试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是价格昂贵，有的产品DNA产率较低。酚仿抽提法虽然操作略微繁琐，但总的来讲价格便宜，而且能够获得高质量的基因组DNA，所以目前应用十分广泛。在利用酚仿抽提法提取基因组DNA的过程中，每一个环节均可影响实验的结果，其中初始样品类型、初始样品量、PK剂量与消化时间和酚抽提次数是重要的影响因素。因此，笔者基于经典的酚仿抽提法对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取和检测高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。
1材料
1.1 试剂
　 生理盐水、蛋白酶K（20mg/ml）、氯仿/异戊醇（24:1）、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、3M NaAC、10×TE Buffer（pH8.0）、5×精子提取液 10ml，混合均匀，高压灭菌，室温保存。
1.2 仪器和耗材
　 仪器设备：滴管、小烧杯；10ul、200ul、1000ul微量移液器；高速冷冻离心机；PH检测仪等；
　 实验耗材：10ul、200ul、1000ul枪头（用于吸取上清的要剪掉枪头尖）；1.5ml×3/样、2ml×1/样；酒精棉球等。
2方法
2.1 不同因素对DNA提取效果的影响
为了使比较基础一致，除改变的步骤外，其余的步骤均使用本文2.3通用方法。
2.1.1 初始样品类型的不同提取效果
　 将精液静置，待其自然分层，上层为精清，下层为精子沉淀。分别从精清和精子沉淀中各取200ul提取DNA，每组3个重复，比较其提取效果。
2.1.2 初始样品量对提取效果的影响
　 分3组，每组4个重复，别取50ul，100ul，200ul精子沉淀来提取DNA，比较其提取效果。
2.1.3 PK消化时间对提取效果的影响
　 分3组，每组2个重复，加入精子提取液和PK后，分别取消化4h、12h、48h来提取DNA，比较其提取效果。
2.1.4 PK剂量对提取效果的影响
　 分两组，每组3个重复，加入精子提取液后，分别加PK10ul和20ul来提取DNA，比较其提取效果。
2.1.5 酚抽提次数对提取效果的影响
　 分两组，每组2个重复，酚抽提分别1次和2次来提取DNA，比较其提取效果。
2.2 不同因素对电泳检测效果的影响
　 分析影响DNA的定性检测的不同因素，所用的DNA全部来自同一管高质量基因组DNA。
2.2.1胶浓度对电泳的影响
　 分3组，每组2个重复，分别用0.8%、1.2%的琼脂糖胶检测。
2.2.2电压对电泳结果的影响
　 分3组，每组2个重复，分别用80V、120V电压检测。
2.2.3上样量对电泳的影响
　 分3组，每组2个重复，分别上样2ug、4ug、6ug基因组DNA。
2.3 通用方法
2.3.1精液DNA提取[1,2]
　 吸取100ul精子沉淀；加入400ul ddH2O、100ul 5×精子提取液、10ul PK（20ug/ul）充分摇匀；55℃水浴直至充分消化至透明状；加入等体积饱和苯酚，缓慢颠倒离心管10min，4℃，12000rpm离心7min，转移上清（500ul左右）至另一离心管；然后再重复一次；用等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）重复上述抽提步骤；用等体积氯仿/异戊醇（24:1）重复上述抽提步骤，将上清转移至2ml的EP管中；在上清中加入1/10体积的3M NaAC（≈50ul）及2.5倍体积的无水乙醇（≈1.3ml，-20℃预冷）（可选：-20℃，2h）轻轻翻转转动至DNA聚集成团，4℃，10000rpm离心2min，离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体；加入75%乙醇（-20℃预冷），让DNA沉淀悬浮于溶液10min，4℃，12000rpm离心2min，离心后倒掉残留液体，再重复洗涤两次； 4℃，12000rpm离心2min，离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体，将DNA自然晾干后，加入100ul TE溶解（可选：37℃助溶1h），检测和稀释分装完毕后于-20℃或-70℃长期保存，原液避免反复冻融，稀释液可储于4℃待用。
2.3.2 DNA定性检测即检测DNA片段大小及完整性
　 制备0.8％ 琼脂糖凝胶；吸取2ul DNA原液，与3ul双蒸水混合稀释，加入1ul上样缓冲液。80V/cm恒压电泳10～100min，同时以大片段Marker作为标记对照物；电泳完毕，置于凝胶成像系统中观测DNA片段大小和亮度及是否存在降解情况；
　 PCR检测：基因为INOS，扩增子长度为390bp，其余均为PCR常规体系和条件。
3 结果和分析
3.1 不同因素对DNA提取效果的影响

 

3.1.1 初始样品类型（精清和精子）的提取效果

　 泳道1、2、3为200ul精子沉淀的提取结果，泳道4、5、6为200ul精清的提取结果；如上图所示，使用自然分层的精液中的精子沉淀提取DNA，待其盐醇沉淀后可以看到DNA沉淀，而使用精清的则无明显沉淀。由此可见，使用精液自然沉淀后的下层精子沉淀比直接使用精清的效果要好。
3.1.2 初始样品量对提取效果的影响

　 泳道1、2、3、4为50ul精子沉淀的提取结果，泳道5、6、7、8为100ul精子的提取结果，9、10、11、12为200ul精子的提取结果，M为DL15000，最大片段15kbp；从图2可以看出，50ul和100ul的精子提取得到的DNA质量很高，均大于15kbp，而200ul精子提取得到的DNA质量较差。由此可见，不是初始样品量越大越好，50～100ul的精子较为合适。

3.1.3 PK消化时间对提取效果的影响

　 泳道1、2为55℃消化48h的提取结果，泳道3、4为55℃消化12h的提取结果，5、6为55℃消化4h的提取结果，M为DL15000，最大片段15kbp；从图3可以看出PK消化不宜时间太长，48h的消化会造成严重的DNA降解，而12h以内的PK消化则不会引起明显DNA降解，4h虽未能使样品消化充分，但已经可以得到一定量的DNA。由此可见，PK消化时间应当控制在4～12h，我们建议6～12h。

3.1.4 PK剂量对提取效果的影响
 

 

　 泳道1、2、3为10ul的PK消化的提取结果，泳道4、5、6为20ulPK消化的提取结果， M为DL15000，最大片段15kbp；从图4可以看出，使用较为常用的常规浓度的PK消化样品会造成部分DNA的降解，而20ul的PK则能够产生较好消化样品。所以PK浓度不宜过低，终浓度至200ug/ml的DNA提取效果较好。
3.1.5 酚抽提次数对提取效果的影响
 

泳道1、2、3为酚抽提两次的提取结果，泳道4、5、6为酚抽提一次的提取结果，M为DL15000，最大片段15kbp；由图5可以看出泳道1～6中点样孔附近均有一些亮点，这可能是大片段DNA和部分残余蛋白质。由此我们可以看出，只经过1次酚抽提得到的DNA其蛋白质污染和经过2次酚抽提得到的DNA差异不那么明显，所以1次酚抽提蛋白就可以满足要求了。
3.2 DNA质量的定性检测
3.2.1 胶浓度对检测的影响
 
   

     
 

       

　 泳道A1、A2为0.8%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道B1、B2为1.2%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M为DL15000，最大片段15kbp；由图6我们可以看出，0.8%的琼脂糖凝胶可以允许大片段DNA（>15～50kb）的通过，所以点样孔附近没有明显亮点。而使用1.2%琼脂糖凝胶检测样品点样孔附近则有明显亮点，这样的结果会使人误认为是蛋白质污染，干扰判断。所以，使用0.8%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA是科学合理的。
3.2.2 电压对检测结果的影响


 

 

　 泳道A1、A2为80V/cM条件下的检测结果，泳道B1、B2为120V/cM，M为DL15000，最大片段15kbp；从图7可以看出，低电压80V/20cM条件下条带清晰细腻，检测效果较好，当电压高达120V/20cM时主带范围变大且有无规则拖带。所以，用低电压80V/20cM电泳检测DNA是更可取的。


3.2.3 上样量对检测的影响


 

 

　 泳道1、2为上样２ul DNA的电泳检测结果，泳道３、4为上样４ul DNA的电泳检测结果，泳道5、6为上样６ulDNA的电泳检测结果，M为DL15000，最大片段15kbp；从图8中可以看出，DNA的上样量对检测结果的影响不大，但检测DNA的量不宜过高，1～2ug即可满足要求。



3.3 PCR检测
 

 

　 泳道1～10为上样10ul的PCR检测结果，目的片段为390bp。结果显示所有样品提取DNA扩增结果均为阳性，这说明本方法提取得到的DNA可以完全满足常规PCR实验的要求。
4 讨论
4.1 猪精子DNA提取液的优化设计
　 提取精液高质量基因组DNA成功的一个关键因素是精子DNA提取液。现有配方的不同点在于醇和盐的使用。目前在精子提取液中添加巯基乙醇比较普遍。经过分析，我们提出了经过优化的如下配方的5×精子DNA提取液，其特点是使用了DTT和NaCl，见表1。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇，常用作还原剂，有抗氧化作用，DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多，而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近[3]。所以，使用DTT不仅环保，而且更加安全有效，而NaCl的存在则可以增加DNA的稳定性。
表1  5×精子DNA提取液

 

组分	添加体积
1M Tris-HCl（PH=8.0 ）	0.5ml
0.5M EDTA-Na（PH=8.0 ）	1ml
5M NaCl	1ml
SDS（10%）	2ml
1M DTT	400ul或加0.06g
ddH2O	5.5ml

4.2. 猪精液高质量基因组DNA提取方法的优化设计
　 基因组DNA提取过程中，每一个环节均可影响实验结果，其中初始样品类型，初始样品量，PK剂量与消化时间和酚抽提次数是重要影响因素。经过对比实验，最终确定了上述环节的最优处理，分述如下：在本研究采用的1.5ml提取体系，使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA，且其添加量为50～100ul的精子沉淀，利用PK终浓度至200ug/ml消化6～12h，随后采用氯仿抽提1次，其余步骤按文中2.1所述，就可以获得高质量的基因组DNA（随机片段>15～30k）。
4.3. DNA定性和定量检测的最优化
　 获得了高质量的基因组DNA，如果没有很好的方法对其进行检测，也会影响我们的研究和生产工作。目前最常用的检测基因组DNA的方法是低浓度琼脂糖凝胶电泳法，该方法即简便又准确。本研究最终确定了用低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.8%，DNA上样量为2ug，电压为80V/cM，电泳至少30min。
5小结
　 笔者对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪育种和保种工作提供技术支持。经过对比实验，最终确定了提取环节的最优处理，分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA；在本研究采用的1.5ml提取体系中加入50～100ul的精子沉淀，利用PK终浓度至200ug/ml消化6～12h，随后采用氯仿抽提1次，其余步骤按文中通用方法所述，就可以获得高质量的基因组DNA。本研究最终确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.8%，电压为80V/20cM，DNA上样量为2ug，电泳至少30min。经检验，利用上述最优化的方法提取得到的猪基因组DNA质量较高，只要保存得当，能够完全满足日常科研和生产需求。

Optimization of DNA extraction from boar sperm and DNA assay
Liu Xiangdong, Xiang Anjing, Peng Zhongzheng, Zhao Shuhong
Key words：pig, boar sperm, DNA extraction, DNA assay, optimization
参考文献
[1]萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)·北京:科学出版社，2002；
[2]卢圣栋.现代分子生物学实验技术，第2版.北京:中国协和医科大学出版社，1999.
[3]DTT化学性质：www.chinaswine.org.cn