摘要：常规育种与分子育种相结合已成当前猪的品种改良及育种的主要途径。本文撰述了猪的分子育种主要领域。结合我们的科研介绍了利用ESR、FSHβ基因提高猪产仔数，剔除Halⁿ基因防治应激综合征。分析了其应用前景。
关键词：猪，分子标记辅助选择，分子标记辅助渗入，分子抗病育种，杂优预测
 
Molecular Breeding and It’s application on Swine

LIU Xiao-chun

(College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural
University, Changsha  410128, China)
Abstract:The combination of conventional breeding and molecular breeding has recently become the main method of the swine breed improvement and breeding. This paper shows the main fields in molecular breeding on swine. According to our research results, it introduces the using of ESR, FSHβgenes to increace the litter size, getting rid of the Halⁿ gene to prevent from porcine stress syndrome.It has analysed their application in the future.
Key Words:swine; molecular markers assisted selection; molecular markers assisted introgression;  molecular breeding of disease resistance; heterosis prodiction
 
　　生物技术是20世纪末人类科技史中最令人瞩目的高新技术，为解决人类的疾病防治、人口膨胀、食物短缺、环境污染治理等一系列问题带来了希望。生物技术的一个重要分枝是分子生物技术，此项技术在动植物的遗传改良、新品种选育等方面已得到越来越广泛应用，为加快动植物的品质改良和生产性能提高，提供了新的途径和方法。本文结合我们的科研项目，就分子生物技术在猪种选育改良中的应用前景作一概述。
1 猪种选育方法回顾
  　 世界各国猪的选种方法。大体上可归纳为表型选择、基因型选择和标记辅助选择三大类型。
1.1 表型选择
　　这个阶段经历了很长时间，1960年前基本上都采用表型选择。从遗传学诞生算起。花了60年时间，从我国最早的“伯乐相马”算起。历时2600多年，由于使用方便，不需要特别的仪器和计算，现在仍被广泛使用，特别是外形选择，仍是客户在选购种猪时的一种主要选种方法。应该说，外形在某种程度上可以反映生产性能高低，如前面所说的父系和母系猪的不同外形要求。就反映了父系与母系猪不同的生产性能要求。因此有必要对不同品种、不同用途的种猪提出较可操作的外形标准．而且要着重与生产性能关系大的外形性状。而不过多地拘泥于“猪毛蒜皮”。还需指出。外形选择毕竟是一种“见好就留”的表型选择，没有涉及遗传基础，因此遗传进展较慢。
1.2 基因型选择
　　随着对基因型有关理论的了解和计算机技术的发展，人们可以透过复杂的表面现象(表型与表型值)，剖析其遗传基础，估算其能遗传的部分。为了取得准确可靠的数据，性能测定制度应运而生，包括生长发育性能测定、繁殖性能测定和肥育与肉质测定，与此相应。研制了一批新的电子设备，如测活体背膘厚的超声波测膘仪，测背膘及眼肌面积的B超，测料重比的种猪性能测定自动化系统．法国ACEMO公司推出的ACEMA64新一代自动化性能测定系统，可以准确记录自由采食条件下群饲猪的个体采食量，料槽内的电子测量系统可使猪的采食量精确到2克。美国OSBOME公司生产的FIRE系统具有相似的功能，除了可测采食时间、采食量外，还可测猪的体重。并通过计算机自动计算，形成猪测定期的日增重、采食量、饲料转化率等数据报表。这套设备虽然投资较大，但可以解决一直困扰人们的群饲猪的料重比指标，还可分析采食行为和计算日增重，为选择提供更准确有效的数据。大量测定数据仍然是表型值，但可通过BLUP法估算出育种值，还可利用遗传评估体系进行场内个体间遗传评估和场问联合遗传评估。场间联合遗传评估必须以准确的数据信息和遗传联结为前提，这方面的工作虽然在我国已试点多年，但困难较多。
1.3 标记辅助选择
　　1986年后。随着分子生物技术的发展．人们逐渐将DNA重组技术、转基因技术、分子标记技术用于猪育种领域，形成了分子育种技术。将有利基闲的分子标记用于选种，形成了标记辅助选择。标记辅助选择(MAS)是目前应用最多的一个领域，是将现代分子生物技术与常规育种方法相结合，借助分子标记选择某一座位基因来改变该座位基因频率的过程。其主要优点是可以用于肉质和抗病力等活体很难度量或活体测量花费很大的性状。以及繁殖等在生命活动中表达较晚的限性性状。由于MAS不受环境影响，且不受性别、年龄限制，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。因此在动物育种中具有广阔的应用价值。
2 分子育种的应用领域和进展
  　 人类基因组计划的提前完成，大大推动了猪等动物的基因组计划。目前美国、欧盟、日本等国的猪基因组计划项目联合开展了猪的基因定位、测序、功能基因研究。现有资料表明^[1-3]，在猪的19对染色体上，分布有30亿左右个bp，有大约3万个基因，在猪的基因图谱上已定位了3000个左右基因或基因标记，其中约2000个为微卫星标记。采用候选基因法和基因组扫描法目前在猪的基因组中发现的大效功能基因和QTL主要有：影响猪产仔数的有位于chr 1p 2.4～2.5区的雌激素受体（estrogen receptor, ESR）基因^[4，5]，位于chr 2p 1.3～1.6区的促卵泡素β亚基（follicle- stimulating hormoneβ, FSHβ）基因^[6]，以及位于chr 7的猪白细胞表面抗原（SLA），位于chr 8的OPN基因，位于chr 16的催乳素受体基因（PRLR）等。影响生长的有位于chr 15p 2.3的抑肌素基因^[7]（myostatin gene, MSTN）、位于chr 9p 2.1～2.6区的肌细胞生成素基因（myogenin gene, MYOG），位于chr 12p 1.2～1.5的猪生长激素（porcine growth hotmone, PGH）基因等。影响肉质性状的有位于chr 6q 1.1～1.2的钙释放通道（calcium release channal, CRC）基因或称兰尼定受体1（ryanodine recepter 1,RYR1）基因^[8]，位于chr 15p 2.1～2.2区的酸肉基因（RN）^[9]。影响肌内脂肪含量的有位于chr 6的心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid  binding  protein, H-FABP）基因^[10]，脂肪组织脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein, A-FABP）基因及肌内脂肪基因（MI）。影响背膘厚和瘦肉率的有位于chr 6p 1.1～1.2的激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase, HSL）基因^[11]，位于chr 18的肥胖基因（obese, ob）^[12]及表达产物leptin及其受体基因，以及黑素皮质素受体（melano- cortin receptors, MCRs）基因等。这些主要功能基因的位置、结构、性质的研究为分子育种提供了基础。
    分子育种是在分子生物学基础上，分子遗传学与数量遗传学相结合的产物，它在猪种选育中的应用领域包括以下方面^[13，14]。
2.1 标记辅助选择
   　 标记辅助选择（marker assisted selection, MAS）是目前应用最多的一个领域，将现代分子生物技术与常规育种方法相结合，借助分子标记选择某一座位基因来改变该座位基因频率的过程。其主要优点是可以用于肉质性状和抗病力等活体很难度量或活体测量花费很大的性状，以及繁殖等在生命活动中表达较晚的限性性状。由于MAS不易受环境影响，且不受性别、年龄限制，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性，因此在动物育种中具有广阔的应用价值。
2.2 标记辅助渗入
   　 标记辅助渗入，或称标记辅助导入（marker assisted introgression, MAI）。就是通过遗传标记将某一基因从一个品种渗入到另一个品种。这不同于改良品种某一缺陷时采用传统的导入杂交方法。在MAI时，当供体品种与受体品种杂交后，在每次回交前先根据标记信息选出携带有渗入基因的个体，并用这些个体与受体品种进行回交，可以保证在回交过程中要渗入的基因不会丢失，大大提高基因渗入的效率。Hanset等（1995）已经将大白猪的正常的等位基因固定在皮特兰中，并在三次回交后获得氟烷阴性的皮特兰品系。
2.3 标记辅助抗病育种
   　 疾病不仅给畜牧生产带来巨大经济损失，也危害生产性状的遗传改进，使选择的效率降低。疾病的防治虽可采用免疫接种、药物、卫生和隔离等措施，但从遗传上根治某些疾病，始终是人们追求的目标。目前已发现猪的疾病主基因或遗传标记有位于6q1.1-1.2 的猪应激综合征的RYRI基因^[8]，位于13q3.1区段的E.coliF4的受体基因^[15]，位于6q1.1区段的与E.coliF18受体位点紧密连锁的α（1，2）岩藻糖转移酶基因FUT1、FUT2^[16]，以及与疾病抗性有关的位于7号染色体上的SLA基因等。利用与疾病抗性有关的基因或基因标记进行抗病力选择，实行标记辅助抗病育种，将可大大加快抗病育种进度，达到根除某些疾病的目的。
2.4 标记辅助保种
  　  畜禽遗传资源保护是世界各国面临的艰巨任务。据FAO（1995）^[17]统计，全世界有猪品种353个，其中亚太地区占157个。我国猪的品种数约占亚太地区的一半。目前，全球处于濒危状态的品种约占26%。保种的方法不外乎活体保种（保全套基因）或所谓系统保种（保有利基因）。由于保种经费的拮据，使保种群不可能太大，这就大大增加了基因丢失的可能性。利用整个基因组标记进行监控，可在保种中使基因丢失的概率大大减少，这就是标记辅助保种。这对于防止基因丢失，特别是一些濒危品种的遗传特性的保护有重大现实意义。
2.5 标记辅助杂优预测
    　在杂优预测中利用整个基因组标记能直接度量个体（乃至品种）的平均基因杂合度，也可计算品种间的遗传距离。利用平均基因杂合度或品种间遗传距离均可预测杂种优势大小，这已为我们的多次试验结果所证明。我们的研究表明^[18]，利用生化多态性位点测定的平均基因杂合度与利用DNA分子标记计算的遗传距离间相关系数为0.7615，而DNA分子标记遗传距离与日增重杂优率、背膘厚杂优率、瘦肉率的杂优率间的相关系数分别达0.9690、-0.6480、0.9936，反映了利用基因组标记预测杂种优势有着广阔前景。
2.6 转基因育种
转基因育种是通过基因转移技术将外源DNA导入某种动物组织中，从而改良重要生产性状（如生长率）、非常规性状（如生产人类的药用蛋白）及抗病性的育种方法。在猪的转基因研究中，最早的研究是将人或牛的生长激素基因导入猪的基因组，由于不能控制DNA扦入的位置及拷贝数，成功率很低。多莉羊的克隆成功，使转基因技术变得容易，成本更低，即将外源DNA首先整合到克隆细胞中，然后转移到胚胎之中。美国PPL Therapeutics采用此法成功地产下了第一只转基因克隆猪。Guelph大学还通过转移植酸酶基因，产生了植酸酶转基因猪，减少了植酸盐对环境的污染。转基因技术还可通过转入人类的有关基因使转基因猪成为人类器官移植的供体。
2.7 性别控制
　　通过产生抗体去掉不需要的X或Y精子技术来控制性别，已研究多年，但效果不明显。然而，近来Blecher等（1999）^[19]提供了一个完整的商业方法，它以所有哺乳动物的X染色体的DNA非常相似为理论基础，假设种间精子表面蛋白质也是非常一致的，这样将公猪的精液注射到公兔体内不会产生雄性特异蛋白的抗体，而产生非性别特异蛋白，剩下的雄性特异分子，注射到雄性动物就会产生抗雄性特异蛋白抗体。要研究解决的是如何产生单克隆抗体使不需要的精子发生凝集而过滤掉。精液性别主要用于提高饲料报酬和胴体瘦肉量，母猪与去势猪相比，饲料报酬提高15%，瘦肉率提高3%，公猪与母猪比，同样提高饲料报酬15%，瘦肉率提高约3%。在集约化养猪中，如果去势猪全部变为母猪则每头每年平均增加60美元，单性别生产还可避免由于不同性别营养需要不同的麻烦，更好的满足营养需要，提高一致性。
3 分子育种的应用前景
    　分子育种与常规育种相结合，边研究边应用，基础研究与应用研究相结合，这是当前研究工作的主流和方向。根据我们科研结果和体会，养猪业中采用分子育种技术至少在以下方面具有良好的应用前景。
3.1 通过标记辅助选择提高猪的产仔数
    　猪的雌激素受体（ESR）基因全长6kb左右，位于1号染色体的p2.4 ～2.5区，其等位基因的差异是由于B等位基因发生了点突变，产生了一个限制性内切酶pvuⅡ的酶切位点，形成AA、BB、AB3种基因型。Rothschild（1996）等^[5]最早对我国梅山猪与西方猪种的杂种猪进行ESR研究，结果表明，BB型母猪第一胎产仔数比AA型高2.3头，各胎总计平均高出1.5头。李宁等^[6]对世界上产仔数最高的我国太湖猪的一个品系二花脸猪研究结果表明，位于2号染色体上的FSHβ基因也是二花脸猪高产仔的特异标记，该基因座BB型与AA型相比，头胎产仔数和产活仔数分别高出2.53和2.12头，各胎平均高出1.5头。我们对外来品种大白猪和长白猪进行了ESR和FSHβ基因的检测和分析，结果表明，大白猪的ESR BB型与AA型相比，平均产仔数高0.50头，产活仔数高0.60头；FSHβBB型与AA型相比，平均产仔数高0.83头，产活仔数高0.55头。长白猪的FSHβBB型产仔数比AA型高1.18头，产活仔数高1.20头，详见表1、表2。
 
表1  ESR基因型母猪的平均产仔数比较
Table 1  The comparison of mean litter size for ESR in sows

品  种(breed)	基因型 (genotype)	胎  数 （No. born）	总产仔数 （TNB）	标准差 （St. D）	产活仔数 （NBA）	标准差 （St. D）
大白 (Large white)	AA	139	10.03a	2.60	8.59a	2.63
	AB BB	320 93	10.19ab 10.53b	2.79 2.94	8.94a,b 9.19b	2.79 2.90
长白 (Laderace)	AA	226	10.62a	2.56	9.52a	2.59
	AB	105	10.71a	2.48	9.72a	2.31
	BB	1	10a		10a

注：字母相同者表示差异不显著，字母不相同者表示差异显著
 
表2  FSHβ基因型母猪的平均产仔数比较
Table 2 The comparison of mean litter size for FSHβin sows

品  种 （breed）	基因型 (genotype)	胎  数 （No. born）	总产仔数 （TNB）	标准差 （St. D）	产活仔数 （NBA）	标准差 （St. D）
大白 (Large white)	AA	49	9.61a	3.05	8.57a	2.73
	AB BB	285 218	10.13a 10.44a	2.73 2.75	8.77b 9.12c	2.88 2.87
长白 (Laderace)	AA	10	9.60a	1.43	8.50a	2.07
	AB	109	10.49a	2.42	9.47a	2.27
	BB	203	10.78a	2.61	9.70a	2.62

注：字母相同者表示差异不显著，字母不相同者表示差异显著
 
　　猪的产仔数是一个非常重要的经济性状，但由于该性状是遗传力低的限性性状，常规选择很难奏效。采用分子标记辅助选择，则可大大加快产仔数的提高。世界著名动物遗传育种学家Chris Haley估计，猪的产仔数提高1头，可给英国养猪业每年增加7亿英磅利润，而整个欧盟每年至少可增利20亿英磅，我国现有约5000万头母猪，采用此项技术使每头母猪每胎增加1头，则每年可增加约800亿元利润，若以推广采用面10%计，每年也可增收80亿元。
3.2 剔除氟烷敏感基因防治猪应激综合征
   　 氟烷敏感基因是猪中发现最早的主基因之一，该基因的隐性纯合子（HalⁿHalⁿ）易产生应激综合征（PSS），Halⁿ还有导致产仔数下降、生长慢、胴体短、瘦肉率高和发生PSE肉的效应，给世界各国造成很大经济损失，美国由于PSE肉造成的经济损失每年在3.2亿美元以上，分子生物技术研究表明，PSS是一种分子缺陷病^[8]，其机制是位于第6号染色体上q1.1～1.2的CRC（或称RYRI）cDNA上的第1843碱基由C突变成T，造成编码氨基酸由Arg⁶¹⁵变成Cys⁶¹⁵，根据这一改变目前已可设计一对引物，用PCR-RFLP法得到3种不同基因型图谱，为养猪业中及早检出氟烷敏感基因携带者（Hal^NHalⁿ）和纯合子（HalⁿHalⁿ）带来极大方便。我省在引进的杜洛克猪群中发现Halⁿ基因频率达0.3766，正在通过检测剔除。
3.3 肠毒素大肠杆菌病的抗病育种
   　 猪病给养猪生产带来的经济损失约占总产值的12%～15%，在猪病中，仔猪泻痢是最普遍而重要的疾病，由腹泻使仔猪的死亡率达11%～29.5%，其中由肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenieE.coli，ETEC）引起的发病率和死亡率约占56.2%和24.7%。值得提出的是ETEC的抗原特性是可变的，已发现的E.coli菌体抗原血清型就有100多种，给研究疫苗及药物治疗带来很大困难。因此，从根本上开展对ETEC抗性遗传机制研究，进行抗病育种已成为近几年的一个研究方向。ETEC有很多种抗原型，其中危害最大的主要有引起1～2周龄仔猪黄、白痢的E.coliK88（F4）和引起断奶后仔猪腹泻和水肿病的E.coli F18。已知E.coli F4是否致病决定于仔猪小肠粘膜上皮细胞有无受体，无受体的猪在受到E. coli F4感染时不发病，表现为抗性；有受体的猪则表现发病。而有无受体受一对等位基因控制，显性基因S控制有受体，隐性基因s为无受体。据此机制，寻找控制受体的基因或标记已成为解决这个难题的关键。为此，我们已从多方面开展了研究，取得了初步成效。
   　 ETEC F18具有类似的遗传机制，目前进展更快，已找到α（1）岩藻糖转移酶基因（FUT1）可作为ETEC F18受体的候选基因。该基因的Hin 6I－RFLP位点的M307处G突变为A时，形成抗性型AA，而GG、AG为敏感型。我们检测中外猪种867头样品发现^[20]，总的来说抗性型个体（AA）较少，在大白、长白、杜洛克猪中平均为6%，其余全部是敏感型（GG、AG），而本地猪种宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪全部属敏感型，无抗性型。这一结果与这些猪种均易感染ETEC病的实际情况一致。但证明了ETEC是可以通过遗传学方法控制的，只要及早对猪只采样检测分型，将AA型留种，淘汰或逐步淘汰GG型、AG型，久而久之，将可使AA型频率升高，GG、AG型频率下降，达到抗病育种之目的。
 
参考文献
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