二十世纪六七十年代，猪人工授精技术开始在我国猪场被采用的一项常规技术，但由于猪常温精液稀释保存技术的不成熟，人工授精技术依然存在不足。进入二十世纪九十年代，随着养猪业开始产业化的发展，现代化的猪人工授精技术规模猪场所普遍应用，这其中的原因是猪常温精液稀释保存技术在九十年代以后取得了飞速的发展，在常温条件下（一般指16～18℃）可保存精液时间延长到了7天以上，当然，保存后的精液活力一般还可达到60%以上，能正常受胎。在这期间，杭州越丰生物科技有限公司一直致力于猪常温精液稀释保存剂的研究与应用推广，并取得了可喜的成绩。在此，笔者把这几年来对猪常温精液稀释保存剂的研究作如下汇报。
 
1 猪常温精液稀释保存剂的研究历史
1.1 猪用常温稀释保存剂的概念
　　猪常温精液稀释保存剂是指在常温（16～18℃）条件下，用于稀释和保存猪合格精液的由专用配方配制而成的生物培养制剂，它能使稀释保存后的猪精液在一定时间内还具有受精能力并能用于猪的人工授精，同时保持正常的受胎率。
1.2 猪常温精液稀释保存剂的研制历史
　　自从20世纪初俄罗斯的Ivanow将人工授精技术应用于猪后，人工授精技术就迅速在世界养猪产业上得到推广，而作为人工授精关键技术的保存稀释液的研究也随之开展。最初，人们只是在采集到的精液中加入了营养物质如葡萄糖和柠檬酸之类，使得稀释后的精液能在体外存活1天以上，但随着人工授精优势的不断体现，人们对优良公猪的基因需要量也越来越大，仅能存活1～3天的精液远远不能满足种猪生产者的期望，由此，进入20 世纪70年代如何使稀释后的精液能在常温条件下更长时间地存活就成了人们研究的重要课题，直至20世纪90年代，伴随着对精子生理功能、化工原料和生物制剂研究的深入，人们把精液在体外的存活时间也延长到了5天以上，并逐渐出现了保存时间达7天以上的长效稀释粉，从而使得人工授精技术在养猪生产上逐渐取代了传统的本交，发挥了其高效安全的作用。在我国，这一研究与应用时间相比世界养猪先进国家则推迟了十年时间，进入到本世纪初，使精液在体外存活5天以上的长效稀释粉才面世。
 
2 猪常温精液稀释保存剂的研制
2.1 精子的生理特性
　　现有的研究已经发现，在精卵结合以前，精子必须具备一定的能力才能受精，这些能力包括到达卵母细胞并穿过透明带、顶体反应、与卵母细胞结合并进入到卵质内等，而这一能力的获得在精子通过附睾时已具备了大部分，但还需在雌性生殖道或体外培养液中获能一部分才具备受精能力。进一步的深入研究还发现，射出的精液中含有去能因子，并知道获能的实质是去除精子表面的去能因子，因而只需培养液或雌性生殖道内含有能中和去能因子的物质就可使精子获能，当然这些能中和去能因子的成分的有效性是在一定的温度、pH和渗透压下保持的。因此，猪常温精液稀释保存剂（培养液）的研制主要就是在精子体外获能时所需的营养、温度、渗透压和酸碱度等几个方面，也就是在精液体外保存过程中，上述几个因素相互作用，保持精子活力，使其获能，以使其有能力到达并与卵母细胞结合以受精。
2.2 猪常温精液稀释保存剂保存时间的研究
　　遵从上述的研究发现，我们从本世纪初开始就对猪常温精液稀释保存剂进行了研制。首先是确定精子能有效获能的条件（包括温度、PH、渗透压）研究，经过多次试制和测定，我们认为，猪用常温稀释保存剂配制后其溶液的pH应在7.2±0.1，其渗透压在290～310osm/kgH₂O，其培养温度在37～39℃，精子只有在这些条件下才能有效获能并受精。科学研究还表明，在精子获能培养液中没有一种绝对必需的成成分，也就是说，培养液中某一成分的存在与否并不是获能的关键，只要培养液中其他成分或内源性能量能保证精子存活，获能就能进行。我们在研制过程中也佐证了这一观点，只要在配方中加入一定的营养物质，精子获能就能进行，并有一定的受精能力，但保存时间则随配方的不同出现很大的差别。简单地说，只需在配方中加入诸如葡萄糖和柠檬酸等物质，就能使采精后的精液在短时间内供人工授精使用，并能取得不错的效果，但若要想较长时间（7天以上）保存，以适合供精站或远途运输，就要在配方中加入更多的物质，以让精子在更长时间内在合适的营养、温度、渗透压和酸碱度条件下获能并具有较强的受精能力，这些物质包括巯基化合物、缓冲剂、氨基酸和抗氧化剂等。
2.3 添加巯基化合物对精液保存时间的影响
　　BSA（Bovine serum albumin）是公认能达到比较理想保存效果的特殊成分，但是，BSA价格昂贵，需要低温保存，在生产中缺乏可操作性，况且，添加动物血清蛋白有内毒素等生物安全的隐患也是需要考虑的问题。鉴于此，我们的技术团队对精液保存期间的精子顶体保护方面花费了大量的时间来探索延长精液保存时间的其他途径。经过大量的实验和理论研究后，找到了一种含有巯基的化合物可以实现去除自由基调节精子代谢活性降低精子顶体损伤的方案。正交试验后，我们选定了项目产品配方的最佳组合，实验数据证明添加巯基化合物的配方能有效延长精子的存活时间，差异极为显著。
对比数据见图1：
图1 精液保存的对比数据

   
 

　　在该精液保存的数据中“4-6数据”、“7-9数据”、“10-11数据”这3组实验的“系列1”就是添加巯基化合物配方的精液保存时间，它们都能在7天以上保存精液活力≥0.7。
　　在取得了这些有效的发现后，我们通过对现有配方的优化和调整，并进行了为期两年的配方筛选。经过多次、多个不同品种的规模猪场试验，最终确定了三个优化配方，分别是保存时间为1～3天、4～6天和7天以上，猪场试验结果表明，使用合格原精经三个配方稀释保存后（不同时间）的精液对母猪进行输精，都达到或超过了各猪场原有本交的水平。这一结果不仅从技术上达到了国外先进国家的水平，而且从实践上促使了规模猪场人工授精普及率的提高，促进了猪场的增收，从而受到了用户的欢迎。三个配方见表1。

表1 越丰保存剂配方
 

主要原料（g）	配方Ⅰ（1～3日）	配方Ⅱ（4～6日）	配方Ⅲ（7日以上）
葡萄糖	5.95	4.8	8.4
二水合柠檬酸钠三钠	12.5	2.35	1.16
碳酸氢钠	0.24	0.39	0.22
EDTA	0.5	1	0.2
柠檬酸	0.56	0.5	0.05
去离子水（ml）	200	200	200
其他	若干	若干	若干

2.4 猪常温精液稀释保存剂产品稳定性的研究
　　在明确了配方与应用效果后，我们使用上述研究成果进行了规模猪场人工授精技术的全面推广，但在实际应用过程中发现，无论哪种稀释粉在环境温度到达35℃时，产品就会出现不同程度的变黄结块现象，从而影响受胎率，影响程度与保存时间有关，也即保存时间越长，出现变黄结块的几率越大。进而的研究发现，这一现象的产生与所加入的物质，尤其是葡萄糖与柠檬酸发生内在的化学反应有关。而这两种物质又是配方中必不可少的，因而针对这一现象，我们从原料优化、配制工艺、生产设备与环境条件等方面进行了研究。首先是对配制所需的原料进行优化，主要是对原料的纯度与生产质量进行选择，经过对比我们发现使用分析纯的原料对质量的改进有较大的帮助。其次，在保证先进工艺和现代生产设备的同时，我们还创造了净化车间的环境条件并改进了生产工艺，引进了先进的干燥设备，此设备利用其热气流使原料悬浮成流化状，原料迅速受热后，其水分被蒸发随气流带出便达到去除结晶水的目的。通过这一系列的有效措施，越丰牌猪常温精液稀释保存剂实现了优秀的热稳定性，试验证明在60℃高温恒湿条件下加速60天后，产品不变色，不结块，化学性能稳定，使产品能在极端高温天气储存运输成为可能。
2.5 抗菌效果的研究
　　众所周知，精子作为一个生物体要在体外存活，必须要尽量避免受到各种病原微生物的侵袭。而猪的精液和精液保存剂中又含有极其丰富的营养物质，给病原微生物创造了生长繁殖的有利条件。因此在精液稀释液中加入抗菌药物，以抑制病原微生物的繁殖，延长精液保存时间，提高受胎率。
我们在配方筛选试验的同时，也对各种类型的抗菌素进行了优选试验，在猪精液保存剂中加入不同浓度的恩诺沙星、庆大霉素、阿米卡星和加替沙星等抗菌素，通过对精子活力和总存活时间的评价，优选出了加替沙星作为配方中的最佳抗菌素，对精子常温保存效果最好，较于对照组的精液活力和总存活时间有显著差异。实验数据见下表2。

表2 越丰配方Ⅲ精液保存剂的抗菌素实验

抗菌素	重复	有效存活时间/h	总存活时间/h
阿米卡星	4	120.00±24	168±24
加替沙星	4	192.00±24	312±24
对照组	4	48.00±0	90±24

 
3 猪用常温稀释保存剂的应用
3.1 应用效果实例
　　在对猪用常温稀释保存剂的研制过程中，我们就开始了其实际应用效果跟踪总结。现举例如下，见下表3。
表3 猪场应用越丰猪常温精液稀释保存剂的效果实例

猪     场	年份	酏种胎数	受胎数	受胎率	均产仔数
浙江诸暨某猪场	2002	927	854	92.1	10.1
浙江萧山某猪场	2003	5562	5173	93.1	9.97
浙江萧山某猪场	2003	6635	6078	91.6	10.2
浙江宁波某猪场	2002	1371	1275	93	9.8
浙江金华某猪场	2004	952	876	92	10.3
浙江海宁某猪场	2003	774	727	93.9	10.1
安徽广德某猪场	2004	1814	1675	92.3	10.5
日本静岗试验场	2002	379	353	93.1	10.8
浙江龙游某猪场	2003	1317	1198	91	10.3

 
　　从上表可以看出，至2002年至2004年，我们所研制的猪常温精液稀释保存剂在生产实践中已取得了很好的效果，这也证明了我们对猪用常温稀释保存剂的研制是成功的。
3.2 猪常温精液稀释保存剂的应用范围
　　至目前为止，应用猪用常温稀释保存剂的范围还只是作为猪场人工授精用的一个稀释粉，这里的原因也是与人工授精的范围有关，经过十几年的努力，猪场特别是规模猪场已经开始理解人工授精的优势了，并已在猪场得到了充分的应用，但我们知道，场内人工授精只是现代人工授精的一个基础，人工授精还应在更大的范围内被应用，诸如供精站、育种规划，进一步在基因工程上都应被充分应用。伴随着我国养猪水平的不断提高，相信这些领域都会大量应用人工授精技术的。而这些领域要应用人工授精技术，长效（7天以上）稀释粉是其成功的前提。因而，长效尤其是超长效（14天以上）的研制与推广应用将是今后一段时间内的重点工作。
 
4 猪常温精液稀释保存剂的研究展望
　　如前述，随着人工授精技术向供精站、育种规划领域的延伸，作为人工授精成功与否的主要技术——稀释保存剂的研制也将进一步的深入，预计未来的几年，长效（7天以上）甚至超长期（14天以上）的稀释粉的研制将会被更多地关注。另一方面，随着基因工程研究的深入或者对猪精子生理研究的深入，猪冷冻精液已显现出其极大的应用价值，因而应用于冷冻精液的专用稀释保存剂的研究也将被各国专家学者所关注，目前，已有配套于猪冷冻精液技术的稀释保存剂在种猪生产上被应用，并取得了一定的效果。此外，与猪用稀释保存剂相关的检测技术与设备的研究也已显示出其必要性与可行性，包括保存剂时间长短效果的检测、精子活力的直观与精确检测等。相信在不久的将来，经过科学工作者的不懈努力，这些研究都将取得成功并被应用于生产实际中，对养猪水平和经济效益的提高都将做出极大的贡献。