摘要：2010年对公司历年保存的PRRSV阳性血清和部分问题猪经RT-PCR检出阳性血清，先后送样8次共62个样品，成功测序59个，用DNAStar 剪切出完整的ORF5序列，进行基因比对和进化树分析，发现核苷酸置换率为58%，同源性从94.7％～100%不等，整体分化成两大类；PRRSV表现出明显的区域性和时间性，各个商品猪场间的序列均有所差异，不同时间段的样品也有差异。测序结果与目前市面上的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV比对，发现公司商品猪场近4年流行的PRRS毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近，表明目前流行的PRRSV以变异株为主。
关键词：猪；蓝耳病；ORF5；基因测序；进化树
 
前言
　　在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。DNA测序技术的目的：测定未知序列；确定重组DNA的方向与结构；对突变进行定位和鉴定；比较研究。
PCR检测技术在上世纪90年代已经应用在动物疾病的检测中，但由于成本较高，检测量相对较少。2005年后，PCR和RT-PCR技术在养殖动物的疫病检测中开始普及应用。基因测序技术，由于早期成本高，仅限于少数科研院校，近年来随着测序成本的大幅下降，近一两年来国内部分规模养殖场开始应用这项技术，尤其以研究猪蓝耳病病毒的演变进化最为常见，测序技术在PRRS的控制与净化中显示出其独到之处。
 
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1仪器：Takara TP 600、英国UVI凝胶成像系统、Hettich MIKRO 22R冷冻离心机、北京六一电流仪和水平电泳槽、净化操作台等。
1.1.2试剂：Taq酶、M-MLV、RNA酶抑制剂、Trizol、DNA Maker等。
1.1.3引物合成与测序公司：上海英骏生物技术有限公司广州分公司。
1.2 方法
1.2.1用常规RT-PCR方法检测出PRRSV阳性的样品。
1.2.2样品经克隆或经PCR大量扩增后送测序公司进行测序。
1.2.3用DNAStar Lasergene 7.1进行序列分析，比对各个样品的测序结果，并制作PRRSV ORF5的演变进化树。
 
2 结果与分析
2.1 全部检测结果与分析
　　2010年公司各商品猪场测序的59个PRRSV阳性样品，剪切出完整的ORF5基因片段（603bp），进行整体ORF5比对，发现核苷酸置换率为58%，两两相互比对，同源性从94.7％～100%不等，整体分化成两大类；PRRSV表现出比较明显的区域性和时间性；各猪场的序列相对都有所不同，不同的时间段检测相对也有所不同。与目前市面上存在的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV进行两两比对，发现公司商品场近4年流行的PRRSV毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近，说明目前流行的以变异株为主（详见表1）。
表1商品猪场59个样品与市面疫苗ORF5同源性比较

疫苗毒株名	最小相似（％）	最大相似 （％）	疫苗毒株名	最小相似（％）	最大相似（％）
RespPRRS MLV	88.20	89.00	Ingelvac ATP	89.20	90.80
ch-1a	93.50	95.00	ch-1R	92.70	94.20
JXA1	97.20	98.70	HuN4-F112	96.50	98.30

 
2.2 商品猪场A检测结果与分析
　　为进一步了解PRRSV测序技术的应用，以A猪场为例进行详细分析，A猪场病料的来源见来源于产房弱仔、产房母猪、保育病猪和流产母猪（见表2），表明PRRSV对各阶段猪只都有影响。
表2 广西农垦永新畜牧集团A商品猪场2010～2011年样品送检测序情况表

编号	猪只状态	耳号	收样时间	测序时间	说明(临床症状)
1	不详		2008年	20100205	发病猪
8	保育猪	-	20100201	20100205	发病猪
9	保育猪	-	20100201	20100205	发病猪
18	保育猪	-	20100603	20100707	发病保育猪
22	产房母猪4头	J222104、J39601、J200802、J396106	20100708	201007014	4头混合样品
25	后备猪	248406	20100712	201007014	发烧
26	产房弱仔	-	20100712	201007014	产房第4栋
30	保育猪	-	20100729	20100812	第3栋发病
31	保育猪	-	20100729	20100812	第6栋发病
32	保育猪	-	20100729	20100812	第7栋发病
33	7周龄保育猪	-	20100801	20100812	8月季度检测（发病）
34	保育猪	-	20100729	20100812	第8栋发病
35	9周龄保育猪	-	20100801	20100812	8月季度检测（发病）
41	断奶弱仔	-	20101006	20101010	产房5断奶弱仔
43	流产母猪	424903J	20101011	20101014	流产母猪
51	流产母猪	J164902、K248708	20101221	20110117	流产母猪
52	保育病猪	-	20101211	20110117	保育病猪
54	产房弱仔	-	20110105	20110117	产房仔猪
56	产房仔猪	-	20101208	20110117	产房仔猪
59	保育	-	20101221	20110117	发病保育猪

 
　　对A猪场20个PRRSV测序结果剪切出的ORF5片段（603bp）进行比对分析，两两比较同源性从95.5%～100%不等，PRRS病毒的进化树如图1，整体核苷酸置换率为53%，A猪场的PRRSV演变成两大类。测序结果表明A猪场内至少存在2种不同的PRRSV。
对2010年8月12日送测序的结果比对分析，发现同源性从96.2%～100%，表明当时7月份采血的发病猪的PRRSV相互间存在差异，可能存在3个毒株，编号30、32和34同源性为100%，为同一毒株；编号31和33同源性为100%，为同一毒株，编号35号与其他的不同，为另一毒株（详见图2）。

 

对2011年1月17日送测序的结果比对分析，发现ORF5的同源性在99.5%～100%，PRRSV在ORF5片段上的变异很小（详见图3）。表明去年12月份和2011年1月采集的发病猪很可能是由一个新的毒株引起。
3 讨论
3.1 蓝耳病病毒和流感病毒类似，变异很快，甚至比PRRSV的变异更快。如何发现PRRSV的变异，这就需要定期对RT-PCR阳性的产物或克隆产物进行测序，分析其序列是否发生变异。长期跟踪测序，可以发现病毒在猪场内部的来源与演变，各个猪场之间是否存在交叉感染，病毒是引种带来还是内部的演变，可以大概推测出新病毒是应用新活苗引入还是通过人员引入等。
3.2 蓝耳病序列的变异大小与致病程度没有绝对的必然联系，虽然有时甚至发生1%差异，都会带来PRRS的爆发；但总体上看，一般来说序列分析同源性越高，即变异越小，对猪场的危害也相对较小。假如猪场发生PRRS需要使用疫苗，如何挑选最合适的疫苗，应该对发病猪采集病料进行测序分析，筛选同源性最高的疫苗用于防制。比如A猪场发生问题，根据20110117的测序结果，与疫苗进行比对，可以选择以HuN4-F112和JXA1毒株制成的疫苗进行试用，因为这两个毒株与当时A猪场PRRSV的同源性均在98%以上。
3.3后备猪的驯化，尽可能用本场完全相似的PRRSV毒株。目前国内外养猪业通用的方法是用本场血清（含PRRSV）或者用序列相似的活苗驯化后备猪。驯化三个月后，才引入母猪场内，防止驯化期间排毒，引发母猪场出现疾病问题。
3.4小区域PRRS的控制与净化方法已经非常明确，也非常有效，但PRRSV的很多机理至今没有搞清楚，因此PRRS还将是养猪业最重要的一个疾病。在机理没有明确的前提下，要想长期控制与净化PRRS，测序与分析工作对猪场的稳定显得十分必要。
3.5 蓝耳病的测序工作不单是某个猪场的问题，应该普及到整个省及国家层面上，建议交流与共享各个省市的测序结果，这样分析起来将更有意义。通过同源分析和进化树分析，甚至可以分析某一新病毒的传播流行状况，到底是内部变异通过猪群、空气传播，还是疫苗本身或其他因素造成。在政府国家层面上进行猪PRRS的控制与净化，收效将会更快。
 
4 结果
　　59个样品经测序后剪切出ORF5进行比对和进化树分析，发现核苷酸置换率为58%，同源性从94.7％～100%不等，整体分化成两大类，PRRSV表现出明显的区域性和时段性。与市面的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV比对，近年来流行的PRRS毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近，表明目前仍以变异株为主。
 
5 致谢
　　在DNAstar软件的应用和分析过程中，得到广西大学谢体三博士和广西兽医研究所马玲的帮助，在此一并致谢！
 
参考文献
【1】DNA测序技术http://www.hudong.com/wiki/DNA%E6%B5%8B%E5%BA%8F%E6%8A%80%E6%9C%AF